摘要：比较《中国药典》2015年版（ChP 2015）与《日本药典》第17版（JP 17）中依达拉奉（1）注射液含量测定方法，并分别采用两种药典方法对日本原研及国内不同厂家生产的依达拉奉注射液进行含量测定。结果表明，日本药典精密度优于中国药典，但测定结果整体偏低。探究其原因，主要在于对照品溶液稀释过程中甲醇与水表面张力不同，移取对照品溶液时产生系统误差，导致移取体积偏大，含量结果偏低。本研究采用芬兰Kibron EZ-Pi Plus便携式动态91视频免费福利实测了相关溶剂的表面张力，证实了该误差的来源。针对此系统误差，改进对照品配制方法，取消稀释操作，采用一步到位直接配制对照品溶液，有效避免了移液误差。改进后的方法测定结果与理论值吻合，操作更为简便。

引言

依达拉奉（edaravone，1）注射液是日本田边三菱制药公司研发的自由基清除剂，于2001年4月首次在日本上市，临床用于治疗急性脑卒中。1注射液已收录于日本药典17版（JP 17）和《中华人民共和国药典》2015年版（ChP 2015）。

含量测定是评价药品质量的重要手段。ChP 2015采用外标法，系统适用性试验要求1峰与杂质I峰的分离度大于8.0；JP 17采用内标法，要求1与内标峰的分离度不小于7，且对照溶液重复进样6次，1峰面积与内标峰面积之比的RSD不大于1.0%。内标法可避免供试品前处理及进样体积误差的影响。考虑到日本为原研国，且原研产品已被国家药品监督管理局药品审评中心选为一致性评价参比制剂，故首选JP 17方法。

本文分别采用JP 17和ChP 2015方法测定1注射液含量，发现JP 17精密度更好，但结果偏低。经分析，这是由于对照品与供试品所用溶剂不一致所致。日本药典亦已对此进行增补修订（JP 17 Supplement I）。本文在此基础上提出另一改进方案，在保证结果准确的同时进一步简化操作。

1 仪器与试剂

LC-20AT型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；UltiMate3000型高效液相色谱仪（美国赛默飞公司）；Thermo BDS HYPERSIL C18键合硅胶柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm）；AB135-S型电子分析天平（瑞士梅特勒公司）。Kibron EZ-Pi Plus便携式动态91视频免费福利（芬兰Kibron公司，Du Noüy–Padday杆状探针法，测量范围1–350 mN/m，分辨率0.001 mN/m，精度0.01 mN/m，单次样品量0.5–3 mL，配循环水浴控温）。

1对照品（中国食品药品检定研究院，含量100%，批号100620-201703）；对氨基苯甲酸乙酯（内标，2，北京伊诺凯科技有限公司，含量98.0%，批号KSBJ926）；1注射液（日本原研，批号B083、C084、C085；国内厂家A，批号1712200、1804023；国内厂家B，批号180115、180212）。甲醇（色谱纯，Sigma-Aldrich公司）；乙酸（分析纯，北京市通广精细化工有限公司）；氨水（分析纯，北京化工厂）；水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 JP 17含量测定方法

2.1.1 色谱条件及系统适用性试验  

色谱柱：C18柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm）；流动相：1%乙酸-甲醇（3:1，加氨水调至pH 5.5）；流速：调整至1出峰时间约8 min；柱温：50 ℃；检测波长：240 nm；进样量：2 μL。对照溶液中1与内标2峰的分离度应不小于7，对照溶液重复进样6次，1峰面积与内标峰面积之比的RSD不得大于1.0%。

2.1.2 测定法  

精密量取1注射液2 mL，置20 mL量瓶中，精密加入0.2%的2甲醇溶液（w/v）10 mL，再用甲醇定容，摇匀，作为供试品溶液。取1对照品15 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，用甲醇定容，摇匀，精密量取2 mL，置20 mL量瓶中，再精密加入0.2%的2甲醇溶液（w/v）10 mL，用甲醇定容，作为对照品溶液。取供试品溶液和对照品溶液各2 μL，注入液相色谱仪，按内标法以峰面积计算，即得。

2.2 ChP 2015含量测定方法

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验  

色谱柱：C18柱；流动相：0.05 mol/L磷酸二氢铵溶液（用20%磷酸溶液调至pH 3.5）-甲醇（50:50）；检测波长：245 nm。分别取1与杂质I对照品适量，加甲醇溶解并稀释制成每1 mL中各含0.5 μg的混合溶液，取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，1峰与杂质I峰的分离度应大于8.0。

2.2.2 测定法  

精密量取1注射液适量，用流动相稀释制成每1 mL中约含150 μg的溶液，作为供试品溶液，精密量取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图；另取1对照品适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每1 mL中约含50 μg的溶液，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。

2.3 含量测定结果比较

按“2.1”和“2.2”项下方法分别对日本原研及国内生产的1注射液进行含量测定，结果见表1；精密度比较见表2。典型色谱图见图1。可见JP方法精密度更好，但测得结果整体偏低。

表1 样品含量测定结果

表2 精密度结果（日本原研批号B083）

图1 ChP 2015（A）与JP 17（B）典型色谱图  

2.4 JP含量测定方法的合理性讨论

分析JP 17含量测定方法，1对照品使用甲醇溶解并稀释，而供试品溶液是1水溶液。由于甲醇的表面张力比水小，使用移液管移取相同体积的甲醇和水时，残留在移液管中的甲醇溶液量比水溶液少，导致对照品实际移取体积比理论体积稍大，从而使1含量测定值偏低。

为定量确认该偏差，本研究采用芬兰Kibron EZ-Pi Plus便携式动态91视频免费福利（25.0 ℃恒温，Du Noüy–Padday杆状探针法）测定相关溶剂的静态表面张力，结果见表3。

表3 25.0 ℃下各溶剂静态表面张力（Kibron EZ-Pi Plus测定）

甲醇表面张力仅为水的约1/3，二者相差约50 mN/m。用同一支A级移液管移取标称2.00 mL液体时，因甲醇残留量明显少于水，实际放出体积偏大。在JP 17原法中，对照品溶液需“甲醇溶解→精密量取2 mL至20 mL量瓶稀释”，该步移取的是甲醇体系，导致对照品实际浓度偏高，按内标法计算所得样品含量偏低。该现象与表1、表2中JP 17法整体读值较ChP 2015低约1.5%、但RSD仅0.09%的结果完全吻合。

2.5 JP含量测定方法的改进

针对上述误差，本文提出省略对照品稀释操作，采用直接一步到位溶解并稀释对照品。改进后的测定方法如下：

精密量取1注射液2 mL，置20 mL量瓶中，精密加入1%的2甲醇溶液（w/v）2 mL，再用甲醇定容，摇匀，作为供试品溶液；取1对照品15 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，再精密加入1%的2甲醇溶液（w/v）10 mL，用甲醇定容，摇匀，作为对照品溶液。取供试品溶液和对照品溶液各2 μL，注入液相色谱仪，按内标法以峰面积计算，即得。

改进后的1浓度和内标浓度与原方法一致，色谱条件及系统适用性试验不变。

2.6 改进后的测定方法结果

按“2.5”项改进方法对日本原研及国内生产的共7批1注射液进行含量测定，结果见表4。改进后含量均接近100%，与ChP 2015结果一致，且精密度良好。

表4 改进后方法样品含量测定结果

3 讨论

3.1 系统误差原因分析

移液管标称体积按纯水校准，不同溶液因表面张力差异导致残留量不同，从而产生系统误差。本研究采用Kibron EZ-Pi Plus便携式动态91视频免费福利实测甲醇与水的表面张力分别为22.1和72.0 mN/m，两者相差约50 mN/m。JP 17原法中对照品溶液移取的是甲醇体系，供试品为水体系，移液管对甲醇的实际放出体积偏大，导致对照品浓度偏高，含量结果系统性偏低。该误差在ChP 2015外标法中因溶剂一致而不出现。

3.2 解决方案

JP 17（Supplement I）通过将供试品用甲醇稀释至80%甲醇比例来统一溶剂，从而消除表面张力差异。本文提出的改进方法则直接取消对照品溶液的稀释步骤，将内标溶液一次性加入含对照品的容量瓶中定容，从根本上避免了移液操作。两种方法均可有效消除系统误差，但本文方法操作更简便、溶媒用量更少，可作为JP 17原法的替代方案。